蛋白纯化柱层析的主要方法及应用

　　在生命科学研究和生物制药领域，蛋白质的高效纯化是获取高纯度、高活性目标蛋白的关键步骤。柱层析技术作为蛋白纯化的核心手段，凭借其操作简便、分离效率高、可规模化放大等优势，被广泛应用于实验室研究和工业生产中。根据分离原理的不同，18luck吧 主要可分为离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析和疏水相互作用层析四种主流方法，每种方法都有其原理、操作要点和适用场景。

 

 

　　离子交换层析是基于蛋白质表面电荷与层析介质上带电基团之间的静电相互作用实现分离的技术。在特定的 pH 环境中，蛋白质会携带不同性质和数量的电荷，当样品溶液流经填充有离子交换树脂的层析柱时，带相反电荷的蛋白质会与树脂表面的功能基团结合，而不带电荷或电荷相同的蛋白质则直接流出。通过改变洗脱液的离子强度或 pH 值，可使结合在树脂上的蛋白质按照亲和力从弱到强的顺序依次洗脱下来，从而达到分离纯化的目的。该方法对蛋白质的分辨率较高，尤其适用于分离等电点差异明显的蛋白质混合物，在重组蛋白的初步纯化阶段应用广泛。
 

　　凝胶过滤层析，又称分子筛层析，其分离原理基于蛋白质分子的大小差异。层析柱内填充的凝胶颗粒具有均匀的多孔结构，当蛋白质混合物流经层析柱时，小分子蛋白质能够进入凝胶颗粒内部的孔隙中，流经路径较长，保留时间较长；而大分子蛋白质无法进入孔隙，只能沿着凝胶颗粒之间的间隙流动，流经路径较短，先被洗脱出来。这种按分子大小进行分离的方式具有条件温和、不改变蛋白质活性的优点，常用于蛋白质的脱盐、分子量测定以及去除样品中的小分子杂质。在蛋白纯化的后期阶段，凝胶过滤层析常被用于进一步纯化和调整蛋白溶液的缓冲体系。
 

　　亲和层析是一种利用生物分子间特异性相互作用进行分离的高效方法，其核心在于层析介质上固定的配体与目标蛋白之间的专一性结合。例如，抗原与抗体、酶与底物、生物素与链霉亲和素等都可作为亲和配对系统。当样品溶液通过层析柱时，目标蛋白会与配体特异性结合而被保留在柱上，其他杂蛋白则随流动相流出；之后通过改变洗脱条件(如加入竞争性配体或调整 pH 值)，可将目标蛋白从柱上洗脱下来。亲和层析具有高的选择性和纯化效率，一步纯化即可达到很高的纯度，是纯化带有标签的重组蛋白的方法。
 

　　疏水相互作用层析基于蛋白质表面的疏水基团与层析介质上的疏水配体之间的疏水相互作用实现分离。在高离子强度的溶液中，蛋白质表面的疏水区域会暴露出来，与疏水介质结合；随着洗脱液离子强度的降低，疏水相互作用减弱，蛋白质按照疏水性从弱到强的顺序被洗脱。该方法适用于分离疏水性差异较大的蛋白质，常与离子交换层析配合使用，在蛋白纯化的中间阶段去除大量杂蛋白。